MF1739_3 Procedimientos experimentales con órganos aislados, tejidos y células de animales

MÓDULO 1. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS DE ANIMALES

1. CULTIVOS DE CÉLULAS, TEJIDOS Y ÓRGANOS PROCEDENTES DE ANIMALES

• Histología y fisiología celular básica.
  • Concepto de morfología y fisiología
  • Niveles de organización. Relación entre estructura y función
  • Clasificación de los tejidos
• Proliferación y diferenciación celular. Adhesión celular.
  • Concepto de proliferación y diferenciación celular (especialización)
  • Factores reguladores: Señales endógenas y exógenas
  • Contacto directo célula-célula. Moléculas de adhesión
• Tipos de células básicas y características tanto morfológicas como fisiológicas.
  • Célula procariota: estructura y funciones básicas
  • Célula eucariota: Organización, estructura y función de los diferentes orgánulos celulares, organización función del núcleo.
  • Descripción de algunos tipos de células que se suelen utilizar en cultivos celulares: tumorales, epiteliales, Tejido conjuntivo, Tejido muscular, Tejido nervioso, Sangre, tejidos linfoides y Células madre.
• Métodos alternativos al empleo de animales en investigación.
  • Ventajas de los ensayos in vitro: Ética y legislación, Control del medio extracelular, Homogeneidad de la muestra, Disminución del gasto y tiempo, objetivables y cuantificables, precisión, reproducibilidad, etc.
  • Limitaciones: Excesiva sensibilidad, Límite de producción, Inestabilidad, Validación del modelo, etc.
• Obtención de células. Cultivos celulares primarios. Obtención de una línea celular.
  • Sistemas para la obtención de células: Banco de células o aislamiento a partir de un tejido
  • Métodos de aislamiento del tejido, disección/disgregación
  • Requisitos especiales para el cultivo de células primarias
  • Ventajas e inconvenientes de la utilización de células primarias.
  • Conservación o mantenimiento células primarias. Requisitos especiales para el cultivo de células primarias.
• Evolución de las líneas celulares y líneas celulares inmortalizadas. Desarrollo de líneas celulares continuas.
  • Tipos de líneas celulares establecidas. Células en monocapa y células en suspensión. Células inmortalizadas y transformadas
  • Preparación de las líneas.
  • Control de los cultivos celulares (pH, sobrecrecimiento, estado del medio, contaminación, etc.)
  • Recuento de células. Preparación de células en suspensión y de células adherentes. Uso del hemocitómetro.
  • Subcultivos de células. Curva de crecimiento.
  • Métodos para aumentar la producción.
  • Ventajas y desventajas de la líneas celulares estables
• Bases de datos y bancos de líneas celulares y material biológico:
  • Qué es un banco de células
  • Bancos internacionales más importantes: American Type Culture Collection (ATCC) y European Collection of Cell Cultures (ECACC), etc.
  • Otros bancos de células: Banco Nacional de Líneas Celulares, etc.
• Anatomía básica de órganos y tejidos empleados en investigación in vitro.
  • Órganos y tejidos más comunes: hígado, corazón, riñón, páncreas, branquias, encéfalo, piel, sangre, etc
  • Ingeniería de tejidos
• Modelos con órganos y tejidos para procedimientos in vitro:
  • Cultivo y baños de órganos
  • Órganos perfundidos
  • Explantes de órganos
  • Órganos reconstituidos
  • Ventajas e inconvenientes de los diversos tipos de modelos in vitro
• Cultivos de órganos:
  • Disección de órganos y tejidos para su extracción.
  • Baños de tejidos y órganos. Equipamiento y medios de conservación.
  • Obtención de explantes. Tamaño de la muestra, Perfusión de la muestra y equipamiento

2. MANIPULACIÓN DE CULTIVOS CELULARES Y CRIOPRESERVACIÓN

• Equipos y material empleados en los cultivos de células y su mantenimiento:
  • Cabinas de flujo laminar: tipos (vertical y horizontal) y nivel de protección (clase I, II y III)
  • Incubadores: mantenimiento del nivel de CO2, temperatura y humedad
  • Microscopios: Estándar e invertidos con ópticas de contraste de fases
  • Frigoríficos, congeladores (de -20º y -80º C) y equipo de criogenia (unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196º C) de líneas celulares)
  • Equipos de esterilización y filtración: autoclaves, esterilización por gas, por calor seco, sistema de filtración, purificación de agua, etc.
  • Otros instrumentos: Balanzas, Baño termostático, centrífugas refrigeradas y no refrigeradas, Equipos de purificación de agua, Micropipetas de volumen variable o de volumen fijo, pHmetro, Pipeteadores automáticos
  • Recipientes para cultivos: Placas de Petri, Multiplacas, Frascos de Roux de diferentes formas y tamaños o Especiales, como las «roller bottles» o con portaobjetos
• Protocolos de trabajo en cabina de flujo laminar y en poyata de laboratorio.
  • Inicio del trabajo en cabina: encendido y puesta a punto de la cabina, desinfección y recomendaciones para el trabajador.
  • Durante la manipulación: distribución del material y utilización de la zona de trabajo, control del flujo y turbulencias de aire, actuación ante un vertido de material contaminado y alarmas.
  • Al finalizar el trabajo: Limpieza, vaciado de material, apagado y cerrado de la cabina
  • Mantenimiento: semanal (limpieza y desinfección de superficie y paredes, mensualmente (revisión de válvulas interiores) y anualmente se certificará por una entidad cualificada.
  • Mesa de trabajo o poyata de laboratorio: orden, limpieza y desinfección
• Protocolos de manejo de placas de cultivos.
  • Apertura del material estéril dentro de la cabina
  • Marcaje de las placas en la tapa y en un lateral de la base, de manera distinta para cada placa, para evitar intercambiar tapas.
  • Toma del medio con la pipeta y transferencia a la placa entreabierta (no retirar la tapa)
  • Tratamiento como residuo según riesgo biológico del cultivo
• Áreas de un laboratorio de cultivo de tejidos.
  • Área de preparación de medios: equipamiento
  • Área de limpieza y esterilización: dimensiones mínimas, organización y equipamiento (máquinas de lavado de material y esterilizadores)
  • Área de transferencia: cabina de flujo laminar/seguridad biológica y otros equipos
  • Área de incubación o cámaras de crecimiento: control de iluminación, temperatura y humedad. Alarmas
• Lavado, esterilización y preparación de materiales:
  • Vidrio: pipetas, probetas, vasos, matraces y botellas de vidrio para preparación, almacenamiento y clasificación de medios y reactivos
  • Plástico: Cultivos en placas y botellas, tubos de ensayo para diferentes técnicas y preparación de alícuotas de los reactivos
  • Lavado, preparación y esterilización del material: área específica del laboratorio, con el método y desinfectantes adecuados
  • Métodos de esterilización: Calor directo, flameado; Calor seco, Horno Pasteur y Calor Húmedo, Autoclave
• Contaminaciones cruzadas y microbiológicas y su prevención.
  • Principales contaminantes: microorganismos, otras líneas celulares del laboratorio y contaminación química
  • Fuentes de la contaminación accidental: origen del cultivo tejido o células, proceso de manipulación del cultivo, empleo de reactivos biológicos contaminados, material contaminado y ambiente de trabajo
  • Prevención para evitar contaminaciones: obtener siempre los cultivos de centros reconocidos que certifiquen el origen; trabajar bajo unas correctas normas de trabajo, limpieza y esterilidad, utilización de Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos), etc.
• Características y naturaleza del sustrato en cultivos celulares.
  • Tipos de sustratos
  • Factores de adhesión celular
  • Interacciones células-substrato: Medios semisólidos: matrices.
  • Métodos de disgregación celular: mecánicos, químicos y enzimáticos
• Medios y reactivos de cultivo celular. Características principales, preparación y renovación.
  • Características de los medios de cultivo celular: composición, osmoralidad, viscosidad, tensión superficial, especificidad, pH, capacidad tamponadora, esterilidad, etc.
  • Componentes y suplementos: Agua, sales, glucosa, aminoácidos y vitaminas. Suero, factores de crecimiento y otros suplementos específicos. Indicador de pH. Pautas par el suplemento con antibioticos
  • Tipos de medios. Medios libres de suero.
  • Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
  • Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración) o esterilizados en autoclave
  • Opciones para la elección, en polvo, líquido concentrado o listo para usar
  • Preparación de medios líquidos, a partir de polvo (filtración), concentrados o esterilizables en autoclave
• Factores de crecimiento y supervivencia de células en cultivo.
  • Hormonas y factores de crecimiento
  • Suero. tipos; suero de ternera (CF), suero bovino fetal (FCS) el suero de caballo (HS) y suero humano (HuS). Sustitutivos del suero
  • Factores que afectan a la supervivencia de las células en un cultivo
• Técnicas de mantenimiento de células en cultivo. Criopreservación de líneas celulares y métodos de identificación. Productos de criopreservación celular.
  • Proceso de almacenamiento por congelación con agentes crioconservantes (glicerol, DMSO,…).
  • Disminución progresiva de temperaturas hasta utilizar depósitos con nitrógeno líquido. Sistemas automáticos para la reducción progresiva y controlada de la temperatura.
  • Factores que se favorecen con la criopreservación
  • Identificación: Datos mínimos de indentificación de cada vial
  • Procedimiento de descongelación
• Empleo de cultivos celulares con fines experimentales. Detección de actividad metabólica y toxicológica.
  • Aplicaciones: estudio de las propias células, clonación, el cáncer, biología del desarrollo, investigación en biología celular y bioquímica, en farmacología y toxicología, obtención de anticuerpos u hormonas, técnicas diagnósticas, etc.
  • Ventajas de la utilización de cultivos celulares en el campo de la toxicidad
  • Limitaciones de los ensayos in Vitro para estudios de toxicidad
  • Ensayos utilizados en pruebas de citotoxicidad: Pruebas citológicas: observación al microscopio, Pruebas bioquímicas. Pruebas de viabilidad (de respuesta inmediata o de corto plazo y de respuesta a largo plazo o de supervivencia)
  • Células asesinas
  • Requisitos de las pruebas de citotoxicidad
  • Preparación de las células efectoras y diana
  • Prueba de citotoxicidad
  • Resultados e interpretación

3. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES CON ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

• Experimentos con cultivos de tejidos de origen animal mediante su exposición a sustancias o elementos terapéuticos o tóxicos.
  • Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos con tejidos y órganos diana. Aplicaciones
  • Estudios del efecto de diferentes sustancias en cultivos de células (primarias o líneas establecidas). Aplicaciones
• Técnicas de valoración del crecimiento y la viabilidad celular.
  • Rojo neutro
  • Prueba MTT
  • Liberación al medio de la láctico deshidrogenasa (LDH)
  • Ensayos de fluorescencia
  • Toxicidad relativa: (concentración efectiva en el 50 % de las células)
• Recolección de células y sus productos.
  • Recolección de las células de los cultivos: centrifugación continua o filtración y extracción en régimen continuo
  • Sistemas cromatográficos para el aislamiento y purificación de las toxinas. Equipos relacionados
• Prevención de riesgos laborales en la manipulación de órganos, tejidos y células.
  • Principales riesgos biológicos
  • Evaluación de riesgos: Propiedades intrínsecas del cultivo celular, como resultado de la modificación genética, como resultado de una infección con agentes patógenos. Condiciones de trabajo
  • Normas de trabajo en los laboratorios de cultivos celulares

4. INSTRUMENTACIÓN Y MÉTODOS DE REGISTRO DE SEÑALES A PARTIR DE ÓRGANOS AISLADOS, TEJIDOS Y CÉLULAS ANIMALES

• Procesamiento de señales:
  • Esquema general: transductor, amplificador y sistema de registro
  • Equipos de espectroscopia de Bioimpedancia eléctrica
  • Equipos de medida de la biomasa
• Transductores: de fuerza, de presión, de temperatura.
• Electrodos para biopotenciales y bioquímicos.
• Ruidos en la salida de datos y métodos de filtrado.
• Programas informáticos de recogida de datos.