MF1740_3 Análisis de biología molecular en muestras biológicas

MÓDULO 1. ANÁLISIS DE BIOLOGÍA MOLECULAR EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

UNIDAD FORMATIVA 1. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS

1. OBTENCIÓN, MANIPULACIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA ANÁLISIS DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS

• Tipos de muestras para análisis de ADN, ARN y proteínas.
  • Extracción de ADN (a partir de sangre, tejidos o células en cultivo, células bucales,…)
  • Extracción de ARN (mediante tiocianato de guanidina, urea-cloruro de lítio, purificación de poli(A)-ARN,
• Determinación analítica. Perfil analítico. Cartera de servicios.
  • Determinación de ácidos nucleicos
  • Separación analítica y preparativa del ADN (electroforesis analítica, geles de agarosa, …)
• Errores más comunes en la manipulación de las muestras.
  • Identificación y etiquetado de las muestras
  • Contaminación (por RNAsas, DNA,…)
  • Degradación enzimática
• Características generales de la obtención y procesamiento de muestras para análisis de ADN, ARN y proteínas.
  • Obtención de ADN y ARN a partir de tejidos líquidos (anticoagular)
  • Inhibidores RNAsas
• Prevención de riesgos en la obtención, manipulación y procesamiento de muestras biológicas.
  • Recepción o toma de muestras. Medidas preventivas
  • Precauciones generales relativas al laboratorio
  • Precauciones durante el desarrollo del trabajo
  • Reglas de higiene personal

2. CONSERVACIÓN Y TRANSPORTE DE MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA ANÁLISIS DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS

• Etiquetado e identificación de las muestras.
• Sistemas y formatos de archivos. Sistemas de almacenamiento.
• Equipos de almacenamiento (-20ºC, – 80º C)
• Transporte de muestras (ADN: descongeladas, tubos estabilizadores ARN, tiempo de transporte recomendado 72 horas. ARN, congelado mediante agentes crioprotectores y con inhibidores de ARNAsas).
• Prevención de riesgos en la conservación y transporte de muestras biológicas.
  • Precauciones durante el desarrollo del trabajo
  • Reglas de higiene personal
  • Almacenamiento de muestras biológicas. Zonas de acceso restringido. Contenedores específicos. Manejo con EPIs
  • Transporte de material biológico. Sistema básico de embalaje. Identificación

3. BIOLOGÍA MOLECULAR: ADN, ARN Y PROTEÍNAS

• Composición molecular, estructura y función de los ácidos nucleicos.
  • Composición química y estructura de los ácidos nucleicos: Nucleótidos de importancia biológica y Factores que estabilizan la doble hélice
  • Funciones de los ácidos nucleicos
• Descripción de las enzimas asociadas a los ácidos nucleicos.
  • Endonucleasas (Tipo 1 y 2)
  • Polimerasas
  • Ligasas
  • Nucleasas
  • Fosfatasas
  • Quinasas
  • ARNasas
• Replicación del ADN.
  • Modo semiconservativo
  • Horqueta de replicación
  • Enzimas que intervienen en el proceso
  • Molécula accesoria: Iniciador
• Transcripción del ADN y su control.
  • Proceso: Cadena molde o antisentido. ARNm o transcripto primario. Enzima que dirige: polimerasa de ARN
  • Modificaciones postranscripcionales.
• Mecanismos de reparación del ADN.
  • Agentes genotóxicos y mecanismos de reparación del DNA
  • Reparación de dímeros de pirimidinas mediante fotoreactivación
  • Remoción de grupos metilo
  • Bases mal apareadas
  • Metilación del DNA
  • Reparación del DNA durante o después de su replicación
  • Reparación de cortes en ambas cadenas del DNA
  • Sistemas De reparación de DNA: NER (Nucleotide Excision Repair)
  • Mecanismos de reparación de DNA: BER (Base escisión Repair)
• Mutaciones del ADN, alteraciones en las proteínas que sintetizan y enfermedades asociadas.
  • Alteraciones que puede sufrir el ADN: Mismatch (mal apareamiento), Desaminación, Pérdida de bases, Unión covalente entre bases de la misma cadena, Unión de grupos alquilo, Ruptura de simple cadena (nick) y Ruptura de doble cadena
  • Alteraciones en las proteínas que se sintetizan y enfermedades asociadas. Desnaturalización
• Estructura y función de las proteínas.
  • Aminoácidos y neurotransmisores
  • Enlaces peptídicos, oligopeptidos y polipeptidos
  • Estructura primaria, secundaria , terciaría y cuaternaria
  • Funciones de las proteínas: estructural, reguladora, de transporte, de reserva, enzimática, mensajera y de receptores químicos
• Transcripción y traducción.
  • Moléculas implicadas en la transcripción y traducción de las proteínas
  • Fases de la transcripción de las proteínas
  • Fases de la traducción de las proteínas
  • Regulación de la transcripción y traducción
• Síntesis y modificación de las proteínas.
  • Moléculas implicadas en la síntesis y traducción de las proteínas
  • Fases de la síntesis de las proteínas
  • Fases de la modificación de las proteínas
  • Regulación de la síntesis y modificación de las proteínas
• Alteraciones conformacionales de las proteínas.
  • Serpinopatías
  • Proteínas priónicas
  • Neuroserpinas
  • Hemoglobina
  • Repeticiones de glutamato
  • Proteína Tau
  • Inmunoglobulinas cadenas ligeras
  • Proteína CFRT Péptido B-amiloide
  • Superóxido dismutasa
  • B2 microglobulina

4. METODOLOGÍA APLICADA A LA SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

• Electroforesis.
  • Tipos de electroforesis: unidimensionales, bidimensionales y técnicas relacionadas.
  • Separación electroforética de las proteínas séricas. Patrones de normalidad y de alteración
  • Características del material y de los reactivos. Averías o disfunciones
• Técnicas cromatográficas.
  • Características de los equipos. Condiciones de uso y mantenimiento
  • Calibración. Averías o disfunciones
  • Características del material y de los reactivos
• Técnicas de inmunodetección.
  • Inmunocitoquímica
  • Western blot
  • Inmunoprecipitación
  • Co-inmunoprecipitación
  • Pull-down
  • TUNEL
• Espectrometría de masas.
  • Fundamento y aplicaciones.
  • Características de los equipos.
  • Condiciones de uso y mantenimiento. Calibración. Averías o disfunciones.
  • Características del material y de los reactivos.
• Tecnología de microarrays y chips de proteínas.
  • Microarrays de ADN: Diseño de un microarrays de ADN. Tipos
  • Microarrays de Proteínas: Diseño de un microarrays de proteínas. Tipos
  • Microarrays de Carbohidratos: Diseño de microarrays de carbohidratos. Aplicaciones
  • Microarrays de Células
  • Microarrays de Tejidos
  • Perspectivas de mercado de los microarrays y biochips en el área de salud humana
• Bioinformática. Bases de datos de proteómica.
  • Genómica funcional
  • Relación entre la biología y la informática
  • Biochips
  • Bioinformática
  • Bibliografía

UNIDAD FORMATIVA 2. ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. METODOLOGÍA APLICADA AL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

• Extracción. Purificación y análisis espectroscópico y electroforético de ácidos nucleicos.
  • Material y métodos
• Amplificación de ADN mediante PCR y variantes.
  • El ADN
  • Los enzimas
  • Los nucleótidos
  • Los cebadores
  • Limitaciones y problemas de la PCR (tamaño secuencias limitado, PCR previa, contaminación, inespecifidad de cebadores,…)
• Electroforesis y técnicas relacionadas.
  • Factores que afectan a la movilidad del ADN en el gel (masa molecular, voltaje, composición de las bases, temperatura, solución amortiguadora,…)
  • Tipos de electroforesis: PFGE (Pulsed Field Gel Electroforesis), OFAGE (Orthogonal Field Alternative Gel), FIGF (Field Inversion Gel Electroforesis), CHEF (Contour Clamped Homogeneus Electric Field), Electroforesis preparative.
  • Aplicaciones: Análisis comparativos de patrones de restricción cromosómicos, construcción de mapas cromosómicos, topología y tamaño de cromosomas, análisis de elementos extracromosómicos
• Hibridación de ácidos nucleicos.
  • Factores que influyen en la hibridación.
  • Composición de las bases.
  • Concentración de ADN/ARN y tiempos Cot y Rot
  • Concentración y tamaño de la sonda
  • Concentración ADN diana
  • Desnaturalización del ADN diana y fijación a un soporte.
  • Marcaje de una sonda monocadena
  • Hibridación: mezcla y renaturalización
  • Detección de los híbridos
  • Medio de reacción
  • Polímeros inertes
  • Tiempos de hibridación y mecanismos de detección.
  • Tipos de hibridación (soporte sólido, en fase líquida, in situ, in situ sobre cromosomas, in situ de bacterias para clonaje).
• Análisis de fragmentos de ADN.
  • Método Southerm
  • Métodos de transferencia (por capilaridad, por vacío, electroforético)
  • Aplicaciones del Método Southerm
  • Mapas de restricción
  • Detección de polimorfismos (RFLP, VNTR, STR) y deleciones.
• Secuenciación.
  • Secuenciación química, método de Maxam y Gilbert
  • Secuenciación enzimática, método de Sanger o de los dideoxinucleótidos.
  • Tipos de secuenciaciones enzimáticas (Cíclica, múltiple, automática, quimioluminiscente)
• Tecnología de microarrays y chips de ácidos nucléicos.
  • Utilidad: analizar el genoma completo de un organismo
  • Fundamento: hibridación con sondas
  • Soporte: placas microtitulación o membranas de blotting
  • Fabricación: pueden ser creados en el laboratorio o usando robótica : Macroarray: señales > 300 micras y Microarray: pocillos < 200 micras
• Aplicaciones: identificación de secuencias (genes, Mutaciones), determinación del nivel de expresión génica, descubrimiento de genes, diagnóstico de enfermedades, Farmacogenómica: desarrollo de Fármacos y Toxicogenómica: investigación Toxicológica
• Bioinformática. Bases de datos de genómica.
  • Introducción a la Bioinformática
  • Consulta de Bases de datos en biología molecular
  • Alineamiento de secuencias
  • Predicción de genes
  • Introducción a los microarrays de DNA

2. PRINCIPIOS GENERALES DE ENFERMEDADES DE BASE GENÉTICA

• Genoma: células, cromosomas y genes.
  • Definición de genoma, gen y cromosoma
  • Organización, estabilización y localización del genoma
• Estructura y función de los genes y cromosomas.
  • Estructura del ADN
  • Estructura del ARN
  • El código genético
  • Secuencias codificantes versus no codificantes
• Bases cromosómicas de la enfermedad.
  • Citogenética. El cariotipo normal en los roedores de laboratorio
  • Anomalías del número de cromosomas (Heteroploidías)
  • Anomalías de la estructura de los cromosomas
• Herencia y enfermedad: enfermedades monogénicas, patrones de herencia, enfermedades poligénicas. Susceptibilidad genética.
  • Genético
  • Congénito
  • Hereditario
• Genética de las enfermedades comunes.
  • Modelos provenientes de mutaciones espontáneas o inducidas
  • Modelos generados por transgénesis
  • Modelos generados in Vitro por manipulación de células ES
  • Modelos generados por transgénesis condicional
• Genética de la reproducción y del diagnóstico prenatal.
  • Modelos animales del desarrollo embrionario
  • Diagnóstico prenatal rápido de aberraciones cromosómicas por PCR
  • Diagnóstico citogenético
  • Diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias
• Diagnóstico en medicina legal y forense.
  • VNTR
  • STR
• Modelos animales de enfermedad de base genética.
  • Modelos murinos de enfermedades hereditarias simples (mendelianas): Desórdenes de la visión, de la audición, neurológicos y neuromusculares. Enfermedades de los huesos y cartílagos, de la piel y el pelo, hematológicas, inmunodeficiencias y metabólicas
  • Modelos murinos de enfermedades hereditarias complejas (multigénicas): Cáncer, obesidad, diabetes, etc.